内皮祖细胞的分离和培养

内皮祖细胞的分离和培养

实验原理

内皮祖细胞(endo thelial prog enitor cells, EPCs)存在于骨髓、脐血和外周血，是血管内皮的前体细胞，参与胚胎时期的血管发生和出生后的血管新生，有促进组织器官, 尤其是缺血组织器官内皮细胞(endothiel cell, EC)修复、建立侧支循环和恢复血供的作用。EPCs对培养体系要求很高，必须要有特异性生长因子血管内皮生长因子诱导和纤连蛋白辅助贴壁下才能够保持良好的生长状态和增殖活性。外周血中所含内皮祖细胞极低，本次试验选用骨髓来分离内皮祖细胞。

实验材料

1. 材料来源:SD小鼠，4周龄，雄性，体重80g

2. 手术器械:解剖剪、解剖镊和止血钳

3. 清洗液:PBS和不含Ca2＋、Mg2＋的HBSS

4. 培养液:DMEM添加10％FBS、10万IU/L青霉素和100mg/L链霉素；含有8％肝素纳（500IU/ml）的PBS

操作步骤

1. 取材:2～3w大鼠，脱颈，取股骨和胫骨。

2. 冲骨:D-PBS冲洗骨髓，收集骨髓冲洗液，离心（100rpm，10min），弃上清，加DMEM混悬。

3. 配细胞分离液:Percoll。

4. A液: Percoll原液和1. 5 mol NaCl（9:1），比重为1.124。

5. B液:A液和0.9% NaCl（6:4），比重为1.076。

6. 梯度离心:缓慢将细胞混悬液1：1加于Percoll液上面，离心（2000rpm，20min），观察细胞分层。

7. 单形核细胞培养:吸出含有单形核细胞的液层，用0.9% NaCl混悬，离心（100rpm，10min），弃上清，加适量培养液，接种于培养皿，37℃、0.5%CO2条件下培养24h。

8. 吸取上层未贴壁单形核细胞，离心（1000rpm，10min），弃上清，加适量培养液，接种于培养皿，37℃、0.5%CO2条件下培养，3～5d传代。

注意事项

1. 取材前现配Percoll 液，4℃放置备用。将细胞混悬液加于Percoll液上面前，应再充分混匀 Percoll液。

2. 须轻而缓慢地将细胞混悬液加于 Percoll液上面，以免破坏两者之间的界面，影响细胞分离效果。

3. 实验操作过程中注意实验器材的灭菌，以及无菌操作

实验讨论

1. 采用这种方法得到的内皮祖细胞里面会混有一些红细胞，经过几天的培养后红细胞会凋亡，再通过换液除去会得到较纯的内皮祖细胞。

2. 镜下观察细胞的形态学发现早期分离的细胞呈圆形，随着时间的推移细胞逐渐呈梭形或多角形，随后会排列呈索状。

3. 对于内皮祖细胞常可通过骨髓或者血液中分离获得，常用的分离方法有Ficoll-Hypaque分离法、percoll分离法、流式细胞分选法，Ficoll-Hypaque分离法、percoll分离法两种方法适合较小数量的细胞，得到的细胞活力较高，但需要进行传代培养才能获得较纯的细胞。流式细胞分选法的细胞数目至少达到107个以上，且分选时间较长细胞活力易受影响，因此应做到操作迅速，需要较长时间适应环境，因此需要静置培养，清洗或换液时操作要轻，但获得的细胞纯度较高。