无菌医疗器械环氧乙烷灭菌的验证方法

【作 者】朱瑞银 陆蓓 何忠平 金华市食品药品检验所（金华 321000） 【内容提要】环氧乙烷灭菌是目前多数无菌医疗器械生产企业采用的灭菌方法。本文介绍了环氧

乙烷灭菌的原理及验证方法。

【关 键 词】医疗器械 环氧乙烷灭菌 验证方法

Validation method of Ethylene Oxide Sterilization for

Sterile Medical Device

【Writer 】ZHU Rui-yin, LU Bei, HE Zhong-ping Jinhua Institute for Food and Drug Control

(Jinhua 321000)

【Abstract 】Ethylene oxide sterilization is a sterilization method for numerous manufacturers of

sterile medical device adopted at present. This article introduces the principle and validation method of ethylene oxide sterilization.

【Key words】Medical Device, Ethylene Oxide Sterilization, Validation Method 1 概述

无菌医疗器械是指产品上无存活微生物的医疗器械，当医疗器械必须以无菌形式供应时，应使用一切可行的手段对医疗器械上的存活微生物进行灭活，以达到无菌要求。有关研究表明，微生物灭活近似于一个指数关系，这就意味着无论灭菌程度如何，微生物总是难免以一个有限概率存活下来，这种存活概率由微生物的数量、抵抗力以及在灭菌过程中微生物所处的环境所决定。所谓“无菌”是指微生物存活概率低于10-6，这是公认的无菌保证水平（Sterile Assurance Level，简称SAL）。对一个灭菌批而言，要证明达到这样的无菌保证水平，势必要对每件产品进行检验，这在实际中是行不通的，因为“试图证明某事件不存在是不可能的”。ISO9000系列标准将那些不能用随后的产品检验和试验来充分证实其结果的过程称之为“特殊”，灭菌就是这样一个特殊过程。因此，ISO13485《医疗器械 质量管理体系 用于法规的要求》中明确规定，无菌医疗器械的灭菌过程必须进行验证。 2 环氧乙烷灭菌

2.1 环氧乙烷特性及灭菌原理

环氧乙烷（Ethylene Oxide，简称EO）又名氧化乙烯，分子式为C2H4O，常温常压下为无色气体，低温下（低于4℃时）为无色液体，具有芳香醚味，沸点10.8℃。EO易燃易爆，空气中浓度超过3%时遇明火即可燃烧爆炸，故EO应保存在特制的安瓿或耐压金属罐中。

EO是一种广谱低温灭菌剂，可在常温下杀灭各种微生物，包括芽孢、结核杆菌、细菌、病毒、真菌等。EO可与蛋白质上的羧基（-COOH）、氨基（-NH2）、巯基（-SH）和羟基（-OH）发生烷基化作用，使微生物蛋白质失去反应基，阻碍其正常化学反应和新陈代谢，从而导致微生物死亡。

EO穿透性很强，可以穿透微孔，达到产品内部相应的深度，从而大大提高灭菌效果，目前大多数无菌医疗器械生产企业普遍采用环氧乙烷灭菌。

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2.2 影响环氧乙烷灭菌效果的主要因素

影响环氧乙烷灭菌效果的主要因素包括：温度、相对湿度、EO浓度、EO作用时间等。 2.2.1 温度

在密闭空间内，温度升高可使气体分子活动加剧，有利于EO分子渗透到本来难以到达的部位，从而提高环氧乙烷的灭菌效率。据测算，温度每升高10℃，芽胞杀灭率提高1倍。然而，在超过一定温度以后，灭菌效率上升不明显，且过高的温度也可能对产品造成损害，因此EO灭菌温度通常为40℃～60℃。在EO作用期间，温度必须保持在设定温度的±3℃范围内。 2.2.2 湿度

一定的湿度是EO灭菌的重要条件，因为水在EO灭菌过程中起着非常关键的作用：①水是烷基化反应的反应剂，能打开EO的环氧基团使其与微生物发生作用，达到灭菌目的；②水能够加速EO的穿透，提高EO穿透速率；③一定的湿度还可缩短被灭菌物品达到所设定温度的时间。比较理想的相对湿度范围是40%～80%，如果相对湿度低于30%，则容易导致灭菌失败。 2.2.3 EO浓度

在一定温度和湿度条件下，适当提高EO浓度可以提高灭菌效率。但EO浓度与灭菌效率之间并不存在固定的比例关系。实验表明，EO浓度达到500mg/L后，再继续提高EO浓度时，灭菌效率的提高已不明显。通常实际EO浓度一般需高于理想EO浓度，因为在实际EO灭菌过程中，还应考虑到EO的损失（如：EO的水解、被灭菌物品对EO的吸附等）。 2.2.4 EO作用时间

EO作用时间是影响灭菌效果的关键因素。因为EO灭菌是气体灭菌，而气体灭菌并非快速灭菌，需要经历足够的时间才能达到灭菌效果。EO作用时间是灭菌验证时有待确定的关键灭菌参数之一，它与温度、湿度、EO浓度相关联，同时还受到被灭菌物品生物负载、包装材料、装载方式等多种因素的影响。 3 灭菌验证

灭菌验证，即是通过物理和生物实验的方法，证明预期灭菌工艺所设定的灭菌工艺过程及参数，能够保证被灭菌物品达到公认的无菌保证水平（SAL＝10-6）。 3.1 安装验证

安装验证时，一要验证灭菌器随机文件和附件的完整性。主要包括灭菌器生产企业合法性的证明文件（如营业执照、许可证、注册证等）、设备相关资料（如安装图、系统图、操作规程、维护指南等）及设备附件（备件）。二要依据供应商提供的灭菌器安装环境要求，对灭菌器工作环境的符合性进行验证。主要是验证防爆、通风设施及EO存放环境等是否符合要求。三要验证灭菌器的安装准确性和整机完整性。主要检查设备实际安装是否符合设备安装要求；检查供电、供水、加药（EO）等配套系统是否完整及安装是否符合规定要求等。 3.2 验证准备

灭菌验证前必须制定预期灭菌工艺及验证实施方案。预期灭菌工艺应包括适用产品、装载方式、灭菌参数等指导实施灭菌的全部内容。验证实施方案主要包括验证所覆盖的产品范围、验证目的、验证时间、验证人员、验证流程、验证要求、验证依据、验证内容、验证方法等内容。验证人员必须熟悉EO灭菌工艺，掌握EO灭菌的相关知识，包括EO理化特性、灭菌原理及有关安全防护知识等。灭菌器操作人员、物理性能鉴定人员、生物性能鉴定人员等特定岗位人员必须经过必要的培训，按有关规定需持证上岗的人员必须取得相应的上岗证。验证过程中所用的所有计量器具，包括灭菌器附带的计量器具，在试运行前必须经检定或校验合格。此外，对于EO灭菌的产品适用性、包装适用性及生物指示剂适用性等也必须经过验证并形成文件，这些验证可与

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试运行同时进行。 3.3 试运行

试运行一般在空载状态下进行，主要是验证为EO灭菌所配套的设施设备是否完善，其性能指标能否满足灭菌工艺要求。

对于预处理区（如果有），主要是验证其空载状态下温湿度均匀性，具体可通过气体循环分布图和温湿度分布图来验证。气体循环分布图可通过烟雾试验结合换气次数和风速测定来获得；温湿度分布图可通过对整个预处理区的温湿度测定来获得。温湿度测定时，一般每2.5m3区域设置一个温度探头和一个湿度传感器，并使各测量点均匀分布。

对于灭菌器，试运行主要包括灭菌室温度均匀性测定和灭菌室物理性能参数测定两项内容。灭菌室温度均匀性又包括灭菌室箱壁温度均匀性和灭菌室空间温度均匀性两部分。温度测定时，温度传感器的分布应能反映整个灭菌室空间的温度分布，灭菌室箱壁温度一般应使用贴触式温度传感器直接贴触箱壁进行测量。测量点的数量，一般灭菌室体积小于或等于5m3时，至少设置10个测量点；灭菌室体积大于5m3时，体积每增加1m3，增加1个测量点；灭菌室体积大于10m3时，至少设置20个测量点。测量点的分布应包括温度变化最大的部位，如靠近灭菌室不受热的位置或柜门，以及靠近蒸汽或气体入口等位置，其余各测量点应在灭菌室内均匀分布。灭菌室物理性能参数的测定主要包括：灭菌室达到真空的程度和速度；灭菌室的正压和负压泄漏率；加入蒸汽时压力升高的程度；加入EO时压力升高的程度和速度；排除EO所需达到的真空程度和速度；以及通入空气（或其它气体）时压力升高的程度和速度等。这些参数的测定应至少进行2次，以验证灭菌器控制的可重现性。 3.4 物理性能鉴定

物理性能鉴定应在满载状态下进行，其目的是验证EO灭菌所配套的设施设备达到预期灭菌工艺参数的能力，为灭菌工艺的制定和修正提供依据。

对于预处理区（如果有），主要是验证满载状态下使被灭菌物品达到预期温湿度范围的能力。测量被灭菌物品温湿度时，一般按下述方法确定传感器数量：产品体积小于2.5m3时，设置5个温度探头和两个湿度传感器；产品体积超过2.5m3时，每2.5m3增加两个温度探头和一个湿度传感器。物理性能鉴定时，被灭菌物品的初始温度应处于或低于工艺规定的最低温度，温度探头和湿度传感器应放入被灭菌物品的包装箱内。

对于灭菌器，主要是验证满载状态下灭菌器达到预期灭菌工艺参数的能力。验证时应测定灭菌室内的被灭菌物品温度均匀性（又称负载温度均匀性），测量点分布可参照灭菌室空间温度均匀性测定时的测量点分布图。此外，鉴定时还应对满载状态下灭菌器各控制系统及灭菌过程的各项物理参数进行验证，主要包括电气控制、加湿、报警等系统和辅助设备的运行验证，以及预真空压力、灭菌温度、灭菌湿度、灭菌压力、EO加药量、换气次数等灭菌过程物理参数的验证。通过这些验证来证明灭菌器在满载状态下有能力达到和保持灭菌工艺所规定的参数要求。 3.5 微生物学性能鉴定

前面所述的物理性能鉴定是为了证明灭菌设备达到预期灭菌条件的能力，而微生物学性能鉴定的目的是为了寻找出一个合理的EO作用时间，并证明在灭菌设备提供的灭菌条件下，经过这一作用时间后，能够确保被灭菌物品达到无菌（SAL＝10-6）。

微生物学性能鉴定前必须对生物指示物的适用性进行验证，即证明所选用的生物指示物能够适用于EO灭菌过程，通常这一适用性证明可由供应商提供或文献证明。一般情况下，EO灭菌微生物学性能鉴定均采用枯草杆菌芽孢（spore of Bacillus subtilis），据证实，Bacillus subtilis NCTC 10073、ATCC 9372是合适的菌株。进行微生物学性能鉴定的产品，应采用与其常规灭菌相同的

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包装，生物指示物应放置在被灭菌物品中最难灭菌的部位，并在预处理前就放入选定部位，且在整个灭菌周期保持该位置。生物指示物监测点的数量应能验证灭菌器内全部被灭菌物品的微生物灭活，通常灭菌室体积小于等于5m3时，至少设置20个监测点；灭菌室体积5m3至10m3时，体积每增加1m3，增加2个监测点；灭菌室体积大于10m3时，体积每增加2m3，增加2个监测点。生物监测点的分布应参照预先制定的生物监测点分布图在被灭菌物品整体中均匀分布，图1给出了具有25个生物监测点的分布图示例。（注：生物监测点分布图、灭菌器空间温度均匀性测量点分布图、负载温度均匀性测量点分布图，可相互参照）。

图1 生物监测点分布图示例

微生物学性能鉴定通常有三种方法：半周期法、存活曲线法和部分阴性法。 3.5.1 半周期法

半周期法就是在除时间外其它所有过程参数不变的情况下，通过将EO作用时间（灭菌时间）依次减半进行试验，直至找到使被灭菌物品达到无菌的最短灭菌时间——即刚好能将生物指示物上的所有微生物杀灭的时间。用这一最短灭菌时间重复两次灭菌过程，若两次试验均能证明生物指示物上无菌生长，则这一最短灭菌时间就是半周期。灭菌工艺规定的实际灭菌时间应至少为半周期的2倍，图2给出了微生物学鉴定的半周期法示意图（图中生物指示物和被灭菌物品生物负载的存活曲线是示意性的，并非代表实际存活曲线；生物指示物含菌量按GB18281.2－2000《医疗保健产品灭菌 生物指示物 第2部分：环氧乙烷灭菌用生物指示物》规定的1×106表示）。

图2 微生物学鉴定半周期法示意图

3.5.2 存活曲线法

存活曲线法就是在除时间外其它所有过程参数不变的情况下，按依次递增的EO作用时间重

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复进行灭菌试验，试验后直接对存活的试验菌进行计数，建立随时间变化的存活曲线，再根据存活曲线求出D值（D值：就是在设定条件下，杀灭90%试验菌所需的EO作用时间）。存活曲线法进行微生物学鉴定时，应至少包括5次EO作用时间，其中一次不加EO或用其它非致死气体代替，同时至少有一次EO作用时间使存活菌总数减少到初始菌量的0.01%以下。用所得的全部存活菌数的常用对数值，对时间（以min为单位）作图，用最小二乘法进行回归分析（回归分析时不应包括初始菌量总数0.5lg范围内的数据点），画出存活菌数量的线性曲线（存活曲线的线性相关系数必须不小于0.8），计算所得直线斜率的负倒数值，即等于以min为单位的D值。 3.5.3 部分阴性法

部分阴性法就是在除时间外其它所有过程参数不变的情况下，重复进行灭菌试验，试验后直接将试验样品用适当的培养基进行培养，观察是否有菌生长，再根据下述方法求出D值。本文主要介绍部分阴性法中通用的Holcomb-Spearman-Karber法（HSKP）。HSKP不要求采用数目相同的重复样本，也不要求固定的时间间隔，但试验结果至少应包含下述7组灭菌结果：①至少有一组试样全部显示有菌生长；②至少有四组试样显示部分样品有菌生长；③至少有两组试样全部显示无菌生长。如下表所示：

EO作用时间

t1 t2 t3 t4 t5 t6 t7

试样显示无菌生长的两个作用时间。

对于t1至t6各次EO作用时间，计算x和y如下：

根据上述xi和yi计算值，得出每次EO作用时间的µi值：

µi＝xiyi

任何试样达到无菌生长的平均时间，可通过t1至t6各作用时间µi之和计算出来：

平均D值（）可按下式求出：

其中，N0为每个试样的初始菌量。

使用平均D值（）的95%置信上限计算灭菌时间Dcalc，按下式计算：

Dcalc＝＋2 试验样品数

n1 n2 n3 n4 n5 n6 n7

显示无菌生长的样品数

r1（=0） r2 r3 r4 r5 r6（＝n6） r7（＝n7）

t1为最短作用时间，所有试样显示有菌生长。t2至t5为量值递增的作用时间。t6和t7为所有

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上式中，方差V按下式计算：

其中α按下式计算：

微生物学性能鉴定的三种方法中，半周期法是最简便和最常用的方法，但并不是很可靠的方法，因为严格来讲，生物指示剂的存活曲线是未知的，所以有条件的企业应该优先选用更严格、更可靠的存活曲线法或部分阴性法。 4 结束语

由于环氧乙烷灭菌不存在通用的经典灭菌参数，影响灭菌效果的因素多且相互关联，灭菌过程控制复杂，所以为了保证环氧乙烷的灭菌效果，对其灭菌过程进行严格的验证是必要的。此外，还值得注意的是，经验证的灭菌参数只能适用于该次验证所对应的灭菌设备、被灭菌物品和装载方式，若灭菌设备、被灭菌物品和装载方式等任何一种因素改变时，均需要重新验证。

参考文献：

[1] GB 18279－2000《医疗器械 环氧乙烷灭菌确认和常规控制》 国家质量技术监督局 [2] GB 18281.1－2000《医疗保健产品灭菌 生物批示物 第1部分：通则》 国家质量技术监

督局

[3] GB18281.2－2000《医疗保健产品灭菌 生物批示物 第2部分：环氧乙烷灭菌用生物批示物》

国家质量技术监督局

[4] GB/T19972－2005《医疗保健产品灭菌 生物批示物选择、使用及检验结果判断指南》 中

华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会

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