多重PCR引物设计

1、 多杀性巴氏杆菌的Km t 及toxA 基因

T +Pm具有Km t 及toxA 基因

T Pm具有Km t基因

PCR引物：

P1: 5′- A TC CGC TA T TTA CCC A GT GG-3′

P2: 5′-GCT GTA AAC GAA CTC GCC AC-3′

P3: 5′- CTT A GA TGA GCG ACA A GG-3′

P4: 5′- GAA TGC CAC ACC TCT A TA G-3′

引物P1，P2检测Pm,扩增片段为457bp;

引物P3，P3检测T +Pm，扩增片段为864bp.

退火温度56℃，时间30秒

2、 禽多杀性巴氏杆菌基因序列（U51470）

引物：

上游引物：5’-TGC CAA AGT TGC CAA TAC TCC-3’

下游引物：5’-TCC CGT CCT CAT TTC TTG CG-3’

退火温度45℃，时间1分钟

3、 猪巴氏杆菌

参考GenBank中猪巴氏杆菌序列设计引物

上游PAS1：5’-AgggCACgCAggCggACTTTTA-3’

上游PAS2：5’-ATCgACAgCgTTTACAgCgTggA-3’

退火温度56.5℃，时间1分钟

4、致病性嗜水气单胞菌（ 嗜水气单胞菌标准株Ah10501）

究针对GenBank 中登录的致病性嗜水气单胞菌的溶血素基因( hlyA ) 、气溶素基因( aerA ) 以及为气单胞菌属所特有的内参照基因16S rRNA 保守区设计了3 对特异性引，非致病性分离株均未扩增出毒力基因hlyA 和aerA ,而致病性分离株则至少含有hlyA 基因

引物：（5’-3’）

aerA-f GCAGAGCCCGTCTATCCAGA

aerA-r CTCCAGCCTCAGGCCTTGAC

hlyA-f ACCTCAACGTCAACCGCAAGAT

hlyA-r GTCTGCGCTTGTCGGTATCCTC

Ah16s-f GGGAGTGCCTTCGGGAATCAGA

Ah16s-r TCACCGCAACATTCTGATTTG

aerA扩增片段为1332bp，hlyA扩增片段876bp，16S rRNA扩增片段356bp

退火温度61℃，时间1分钟

5、 致病性嗜水气单胞菌特异性16S rDNA 和气溶素基因（Aerolysin）

登录Genbank ,查找已发表的气单胞菌各种的16S r

DNA 序列, 参照Dorsch 等的方法, 用DNAtool软件设计对引物。

P1 : 5’ -GAAAGGTTGATGCCTAATACGTA – 3’ ,

P2 : 5’- CGTGCTGGCAACAAAGGACAG -3’

通过登录Genbank 查找已发表的各种气单胞菌的Aero 基因, 通过Primer 软件设计1 对引物:

P1 : 5’ -GAGAAGAAGCCCAGAGCG – 3’

P2 : 5’-AGTTGGTGGCAGTATCGTAA – 3’

前者退火温度60℃，时间1分钟；后者退火温度50℃，时间1分钟。

6、 鱼源嗜水气单胞菌的丝氨酸蛋白酶基因序列

从Genebank 中读取2 种鱼源A h 丝氨酸蛋白酶基因, 其名称分别为A F159142 和A F126213。随后利用DNA tool 在其ORF 内高度保守序列中设计1 对引物, 上游引物(P1) 5′端加Bam I 酶切位点, 下游引物(P2) 5′端加HindⅢ酶切位点。其序列为:

P1: 5′- A TTGGA TCCCTGCCTA TCGCTTCA GTTCA-3′

P1: 5′-GCTAA GCTTGCA TCCGTGCCGTA TTCC-3′

其中P1 与丝氨酸蛋白酶基因的49～ 69 位核苷酸相同, P2 与丝氨酸蛋白酶基因的923～ 941 位的核苷酸互补。这对引物可扩增出长度为893 bp 的DNA 片段

退火温度55℃，时间1分钟。