5-氮杂-2’-脱氧胞苷对人肝癌细胞株SMMC7721增殖及DAPK mRNA表达的影响

张朴，等．广西地区先天性心脏病家族遗传聚集现象探讨　ｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ　ｈｅａｒｔ　ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｃｈｉｎ　Ｍｅｄ　Ｊ　常［Ｊ］．中国超声医学杂志，２０００，１６（２）：１５７—１５８．　（Ｅｎｇ１），２００９，１２２（４）：４１６—４１９．　Ｅ７］　Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ　ｏｆ　Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ　Ａｄｕｌｔ　Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ　Ｈｅａｒｔ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｅ２２　高秉仁，岳凤珍．甘肃六地市先天性心脏病流行病学研　ｉｎ　Ｇｒｅｅｃｅ：Ｎｅｅｄ　ｆｏｒ　ａ　Ｓｔｅｐ　Ｆｏｒｗａｒｄ，Ｈｅｌｌｅｎｉｃ　Ｊ　Ｃａｒｄｉ—　究［Ｊ］．中国循环杂志，２０００，１５（５）：２９８—２９９．　ｏｌ，２Ｏ１１，５２：１９３　１９４．　［３］　岳凤珍，高秉仁．先天性心脏病家系的遗传学研究［Ｊ］．　［８］　Ｗｈｉｔｔｅｍｏｒｅ　Ｒ，Ｗｅｌｌｓ　ＪＡ，Ｃａｓｔｅｌｌｓａｇｕｅ　Ｘ．Ａ　ｓｅｃｏｎｄ—ｇｅｎ—　中国优生优育，２００１，１２（１２）：５７　６１．　ｅｒａｔｉｏｎ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　４２７　ｐｒｏｂａｎｄｓ　ｗｉｔｈ　ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ　ｈｅａｒｔ　ｄｅ—　ｒ４］　Ｂｅｎｓｏｎ　ＤＷ，Ｓｉｌｌｂｅｒｂａｃｈ　ＧＭ，Ａｎｎ　ＫＭ，ｅｔ　ａ１．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｆｅｃｔｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　８３７　ｃｈｉｌｄｒｅｎ［Ｊ］．Ｊ　Ａｍ　Ｃｏｉｌ　Ｃａｒｄｉｏｌ，　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃａｒｄｉａｃ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ＮＫＸ２—５　ａｆｆｅｃｔ　ｄｉｖｅｒｓｅ　１９９４，２３（６）：１　４５９—１　４６７．　ｃａｒｄｉａｃ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｐａｔｈｗａｙｓ［，Ｊ］．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ，１９９９，　［９］　Ｄｒｉｓｃｏｌｌ　ＤＪ，Ｍｉｃｈｅｌｓ　ＶＶ。Ｇｅｒｓｏｎｙ　ＷＭ。ｅｔ　ａ１．Ｏｃｃｕｒ—　１０４（１１）：１　５６７－１　５７３．　ｒｅｎｃｅ　ｒｉｓｋ　ｆｏｒ　ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ　ｈｅａｒｔ　ｄｅｆｅｃｔｓ　ｉｎ　ｒｅｌａｔｉｖｅｓ　ｏｆ　ｐａ　Ｅ５２尹小妹，郦志军．同一家族房缺３例报道ＥＪ３．心肺血管　ｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ａｏｒｔｉｃ　ｓｔｅｎｏｓｉｓ，ｐｕｌｍｏｎａｒｙ　ｓｔｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ　ｓｅｐｔａｌ　病杂志，１９９７，１６（４）：３０１－３０１．　ｄｅｆｅｃｔ，［Ｊ］．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１９９３，８７（Ｓｕｐｐｌ　２）：１１４—１２０．　［６］刘　峰，何静媛．彩超诊断一家族性房间隔缺损发育异　广西医科大学学报２０１２　Ｆｅｂ；２９（１）　５一氮杂一２’一脱氧胞苷对人肝癌细胞株ＳＭＭＣ７７２１增殖及　ＤＡＰＫ　ｍＲＮＡ表达的影响　谢海仇小强　余红平△　李孟英。△　（广西医科大学公共卫生学院流行病学教研室　南宁　５３００２１）　摘要　目的：探讨去甲基化药物５一氮杂一２　脱氧胞苷（５　Ａｚａ一２’ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ，５－Ａｚａ—ＣｄＲ）对人肝癌细胞株ＳＭＭＣ７７２１细胞增　殖以及对死亡相关蛋白激酶（Ｄｅａｔｈ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ，ＤＡＰＫ）基因ｍＲＮＡ表达水平的影响。方法：用不同浓度（０．５，　５．０，５０．０　ｔＬｍｏｌ／Ｌ）的５－Ａｚａ－ＣｄＲ对ＳＭＭＣ７７２１细胞处理后，采用ＭＴＴ法检测细胞的增殖情况；半定量ＲＴ－ＰＣＲ法检测各组　细胞ＤＡＰＫ　ｍＲＮＡ的表达水平。结果：５－Ａｚａ—ＣｄＲ对肝癌细胞株ＳＭＭＣ７７２１生长有明显抑制作用，并且存在剂量依赖性反应　关系（Ｆ一２４２．４０，Ｐ＜Ｏ．Ｏ１）；半定量ＲＴ—ＰＣＲ结果显示，ＭＭｃ７７２ｌ细胞中ＤＡＰＫ　ｍＲＮＡ表达水平很弱，采用不同浓度５一　Ａｚａ—ＣｄＲ处理ＳＭＭＣ７７２１细胞７２　ｈ后，ｓＭＭＣ７７２１细胞中ＤＡＰＫ　ｍＲＮＡ表达水平呈剂量依赖性逐渐升高（Ｆ一３６０．４１，Ｐ　＜Ｏ．０１）。结论：５　Ａｚａ—ＣｄＲ可诱导ＭＭＣ７７２１细胞ＤＡＰＫ　ＩＴＩＲＮＡ表达，并抑制ＳＭＭＣ７７２１细胞增殖。　关键词　肝癌细胞；５一氮杂一２　脱氧胞苷；死亡相关蛋白激酶；ＤＮＡ甲基化；细胞增殖　中图分类号：Ｒ７３０．２　文献标志码：Ａ　文章编号：１００５—９３０Ｘ（２０１２）０１—００１３－０４　ＥＦＦＥＣＴ　ＯＦ　５一ＡＺＡ—ＣＤＲ　ＯＮ　ＣＥＬＬ　ＰＲｏＬｌＦＥＲＡＴｌＯＮ　ＡＮＤ　ＭＲＮＡ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ　ＯＦ　ＤＡＰＫ　ＩＮ　ＨＵＭＡＮ　ＨＥＰＡＴＯＭＡ　ＣＥＬＬ　ＬＩＮＥ　ＳＭＭＣ７　７　２　１　ＣＥＬＬＳ　Ｘｉｅ　Ｈａｉ，Ｑｉｕ　Ｘｉａｏｑｉａｎｇ，Ｙｕ　Ｈｏｎｇｐｉｎｇ，Ｌｉ　Ｍｅｎｇｙｉｎｇ．（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，Ｇｕａｎ一　ｇｘｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｎｉｎｇ　５３００２１，Ｃｈｉｎａ）　＊基金项目：广西自然科学基金（Ｎｏ．０８３２２８８）；国家自然科学基金　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｏｂｊｅｅｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＤＮＡ　（３０６６０１６２）；国家自然科学基金（３０８６０２４７）；广西自然科学基金　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　５－Ａｚａ　２’一ｄｅｏｘｖｃｖｔｉｄｉｎｅ（５一Ａｚａ—　（Ｎｏ．０９９１１２６；０８３２０１７Ｚ）；广西科学研究与技术开发项目（桂科攻　Ｎｏ．０７Ｉ９００６—２—１３；０９９３００３Ｄ－４）；广西大型仪器协作网测试补助　ＣｄＲ）ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｈｅｐａｔｏｍａ　ｃｅｌ１　１ｉｎｅ　（６６８－２００８—０８１）　ＳＭＭＣ７７２１　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｕｍｏｒ　ｓｕｐ—　△通信作者：李孟英，Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｉｍｅｎｇｙｉｎｇ２３０＠ｓｉｎａ．ｃｏｒｎ；　ｐｒｅｓｓｏｒ　ｇｅｎｅ　ＤＡＰＫ　ｍＲＮＡ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｈｕｍａｎ　ｈｅｐａ—　余红平。Ｅ—ｍａｉｌ：ｙｕｈｏｎｇｐｉｎｇ　＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｒｎ　ｔｏｍａ　ｅｅｌ１　ｌｉｎｅ　ＳＭＭＣ７７２　１　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆ—　１桂林医学院　ｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ（０．５，５．０，５０．０　ｕｍｏｌ／Ｌ）ｏｆ　５一　２中国人民解放军第３０３医院　收稿日期：２０１２—０１－０５　Ａｚａ一２’ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ．Ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＤＡＰＫ　ｍＲＮＡ　ｉｎ　ＳＭＭＣ７７２１　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　・　１４　・　广西医科大学学报２０１２　Ｆｅｂ；２９（１）　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ＭＴＴ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ　ａｎｄ　ａ　ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　（ＲＴ—ＰＣＲ）ａｓｓａｙ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＳＭＭＣ７７２１　ｃｅｌｌｓ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｉｎ　ａ　ｄｏｓｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｍａｎｎｅｒ（Ｆ一２４２．４０，Ｐ＜０．０１）．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＤＡＰＫ　ｍＲＮＡ　ｗａｓ　ｖｅｒｙ　ｗｅａｋ　ｉｎ　ＳＭＭＣ７７２１　ｃｅｌｌｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ。ａｆｔｅｒ　ＳＭＭＣ７７２１　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ５一Ａｚａ—ＣｄＲ　ｆｏｒ　７２　ｈｏｕｒｓ，ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓ　ｓｉｏｎ　Ｉｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ＤＡＰＫ　ｍＲＮＡ　ｗｅｒｅ　ｇｒａｄｕａｌｌｙ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｉｎ　ａ　ｄｏｓｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｍａｎｎｅｒ（Ｆ一３６０．４０，Ｐ＜　０．０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：５－Ａｚａ—ＣｄＲ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ＳＭＭＣ７７２１　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｉｏｎ　ｏｆ　ＤＡＰＫ　ｍＲＮＡ　ｉｎ　ＳＭＭＣ７７２　１　ｃｅｌｌｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　ｈｅｐａｔｏｍａ　ｃｅｌｌｓ；５－Ａｚａ　２’一ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ；ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；ｄｅａｔｈ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ；　ＤＮＡ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　肝细胞癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，具有发现晚、　发展快、治疗难、预后差等临床特点　］。我国每年约有１１万　人死于肝癌，居恶性肿瘤死亡率的第２位ｌ２］。肝癌的发生发　展是一个涉及到多基因改变的复杂过程，包括基因突变、基　因缺失、基因过表达和基因表型改变等，其中基因表型改变　包括ＤＮＡ甲基化与组蛋白乙酰化状态异常等形式∞］。ＤＮＡ　甲基化是表观遗传修饰的主要方式之一ｌ＿４］。肿瘤表观遗传　学认为在抑癌基因启动子区的ＣｐＧ岛高甲基化可导致相应　的基因失活并导致癌症的发生，但这种变化是可逆转的，通　过去甲基化药物处理能够恢复相应的抑癌基因的正常表　达ｌｃ　。死亡相关蛋白激酶基因（ｄｅａｔｈ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉ—　ｎａｓｅ，ＤＡＰＫ）位于人染色体９Ｐ３４．１。ＤＡＰＫ是细胞凋亡中　的一种钙／Ｎ调蛋白依赖性正调节因子并与细胞骨架形成有　关［　。钱波等　研究发现，７７．５　的原发性肝细胞癌患者肝　癌组织存在ＤＡＰＫ基因启动子去甲基化，而正常肝组织则无　基因甲基化。去甲基化治疗已成为一种新的抑制细胞增殖　和诱导细胞分化的肿瘤治疗方法，在恶性肿瘤治疗中具有良　好的应用前景　。本文以人肝癌ＳＭＭＣ７７２１细胞株为研究　对象，研究在体外去甲基化药物对肝癌细胞株的增殖及其细　胞中ＤＡＰＫ　ｍＲＮＡ的诱导表达情况，为探索肝癌的发生发　展机制及治疗方法提供理论依据。　１材料与方法　１．１材料：人肝癌细胞株ＳＭＭＣ７７２１来源于广西医科大学　中心实验室。５－Ａｚａ　ＣｄＲ和溶剂二甲基亚砜ＤＭＳＯ购自美　国Ｓｉｇｍａ公司，ＭＴＴ购自美国Ａｍｒｅｓｃｏ公司，ＲＰＭＩ１６４０培　养基购自美国Ｇｉｂｃｌ公司，小牛血清购自杭州四季青生物公　司工程材料有限公司，９６孔、１２孔无菌培养板购自广州洁特　生物过滤制品有限公司。ＰＣＲ引物用引物设计软件Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐｒｅｍｉｅｒ　５．０设计，内参引物为人－ａｃｔｉｎ基因，均由上海生工　生物工程有限公司合成。总ＲＮＡ提取试剂盒购白天根生化　科技（北京）有限公司，ＲＴ　ＰＣＲ试剂盒ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ　ＴＭ　Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ购自美国Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司，Ｄｒｅ—　ａｍＴａｑ　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ购自美国Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司。　１．２方法　１．２．１细胞培养：用ＲＰＭＩ１６４０培养液（含１Ｏ　小牛血清，　１００　Ｕ／ｍＬ青霉素，１００　ｕ／ｍＬ链霉素）在３７℃５　ＣＯ２饱　和湿度条件下培养ＳＭＭＣ７７２１细胞。每隔２４　ｈ换液一次，　在细胞接近铺满培养瓶或培养板底时（４～５　ｄ），进行细胞传　代。　１．２．２药物处理及噻唑蓝ＭＴＴ法检测对ＳＭＭＣ７７２１细胞　株的生长抑制作用：用１　ｍＩ　ＤＭＳＯ溶解药物５－Ａｚａ—ＣｄＲ后，　配置含３种不同药物浓度（０．５，５．０，５０．０　Ｆｍｏｌ／Ｉ　）的ＲＰ　ＭＩ１６４０培养液，ＤＭＳＯ最终浓度小于５‰。用含相同浓度溶　剂ＤＭＳＯ的ＲＰＭＩ１６４０培养液培养细胞作为对照。取对数　生长期的肝癌ＳＭＭＣ７７２１细胞，调整细胞悬液浓度，按每孔　５×１０。个细胞接种于９６孔板中，每７Ｌ￣ｌＪ人细胞悬液１００　ＦＩ　。　每块９６孔板中都设有４组，一组是含相同浓度ＤＭＳＯ溶剂　的实验对照组，其他３组分别是一组是加人０．５，５．０，５０．０　“ｍｏｌ／Ｌ三种浓度药物５　Ａｚａ—ＣｄＲ的实验组，每组设５个复　孔。将各组细胞置３７　Ｃ　５　ＣＯ。培养箱中培养，每隔２４　ｈ　换液一次，连续培养７２　ｈ后倾去培养基，用ＰＢＳ清洗后更换　正常ＲＰＭＩ１　６４０培养液，各孔加入５　ｍｇ／ｍＬ　ＭＴＴ　１０　ＦＩ　继　续培养４　ｈ，小心吸出每孔中的液体，各￣Ｌ／Ｊｎ入ＤＭＳＯ　２００　ＦＬ，　置摇床上低速振荡１０　ｍｉｎ，使结晶物充分溶解，用空白对照　组进行调零，在自动酶标仪４９０　ｎｍ处测量各孔的吸光度值　（Ａ４９０值），以上实验重复３次。　１．２．３半定量ＲＴ　ＰＣＲ法检测各组细胞ＤＡＰＫ　ｍＲＮＡ的　表达：各组细胞培养７２　ｈ后，更换正常培养液继续培养２４　ｈ，　用总ＲＮＡ提取试剂盒提取细胞内所有ＲＮＡ，用两步法将所　有ＲＮＡ逆转成ｃＤＮＡ后进行ＰＣＲ实验，ＤＡＰＫ引物序列　为：５　ＧＴＧＡＡＣＡＴＣＡＡＧＡＡＣＣＧＡＧＡＡＧ３　（上游），５　ＴＴＡＣＣＴＣＣＡＴＣＴＧＡＣＡＣＣＧＴＣＴ３　（下游），长度为１６９　ｂｐ。　作为内参的人Ｇ　ａｃｔｉｎ引物序列为：５　ＴＧＡＣＧＴＧＧＡＣＡＴＣ～　ＣＧＣＡＡＡＧ３　（上游），５　ＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡ　ＣＡＧＣＧＡＧＧ　３　（下游），长度为２０５　ｂｐ。反应体系均为：ｍｉｘ　１２．５　Ｌ，去离　子水１０．５“Ｌ，上游引物０．５　ＦＬ，下游引物０．５　ＦＩ　，ｃＤＮＡ　１．０　ＭＩ　共２５“Ｌ。ＤＡＰＫ基因及内参基因－ａｃｔｉｎ的扩增在　不同管内进行，扩增反应条件：９５。Ｃ　５　ｍｉｎ预变性，９５　Ｃ变　性３Ｏ　ｓ，（ＤＡＰＫ：６０℃，Ｂ　ａｃｔｉｎ：６６℃）退火１　ｍｉｎ，７２　Ｃ延伸　１　ｍｉｎ，３０个循环，７２。Ｃ继续５　ｍｉｎ让反应充分完成，４　Ｃ暂时　保存，实验重复３次，取ＤＡＰＫ及内参引物扩增产物各５　ｌｘＩ　，　２　琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统（Ｇｅｌ　ｄｏｃ　２０００，美国　Ｂｉｏ—Ｒａｄ公司）拍照及分析表达情况。　谢海，等．５一氮杂一２’一脱氧胞苷对人肝癌细胞株ＳＭＭＣ７７２１增殖及ＤＡＰＫ　ｍＲＮＡ表达的影响　・　１５　・　１．３统计学处理　生长抑制越明显（Ｆ一２４２．４０，Ｐ＜Ｏ．ｏｉ），任意两组间比较，　Ｐ均＜０．０５（见图１）。　实验数据采用均数±标准差表示，采用单因素方差分析　的方法分析在不同浓度药物处理下细胞株细胞增殖及　ＤＡＰＫ基因ｍＲＮＡ表达水平的差异。数据统一采用　２．２　５－Ａｚａ—ＣｄＲ对肝癌细胞株ＳＭＭＣ７７２１ＤＡＰＫ　ｍＲＮＡ表　达的影响：半定量ＲＴ—ＰＣＲ试验结果显示，肝癌ＳＭＭＣ７７２ｌ　细胞在正常培养条件下ＤＡＰＫ基因表达收到明显抑制。使　用５－Ａｚａ—ＣｄＲ处理７２　ｈ后，肝癌ＳＭＭＣ７７２１细胞ＤＡＰＫ基　ＳＰＳＳ１８．０统计软件包进行统计分析，所有统计检验均为双　侧检验，检验水准“一０．０５。　因ｍＲＮＡ重新表达，且随药物浓度的增加，ＤＡＰＫ　ｍＲＮＡ表　２　结　果　２．１　５　Ａｚａ—ＣｄＲ对肝癌细胞株ＳＭＭＣ７７２１增殖的影响：肝　癌细胞株ＳＭＭＣ一７７２１在５－Ａｚａ—ＣｄＲ作用７２　ｈ后出现明显　达相应增加，各组差异具有统计学意义。而且ＤＡＰＫ　ｍＲＮＡ　相对表达量与药物浓度存在剂量依赖反映关系（Ｆ：　３６０．４１，Ｐ＜Ｏ．Ｏ１），任意两组间比较，Ｐ均＜Ｏ．０５。（见图２　及表１）。　的生长抑制，而且随着药物浓度的增加，ＳＭＭＣ－７７２１细胞的　对照０．０　ｐｍｏｌ／Ｌ组　Ｏ．５　Ｕ田０ｌ几组　５．０　１ａｍｏｌ／Ｌ￣ｆＩ　５０．０　ｐｍｏｌ／Ｌ组　按药物浓度分组　图１　５－Ａｚａ—ＣｄＲ对肝癌ＳＭＭＣ一７７２１细胞增殖的剂量一效应图　Ｍ　１　２　３　４　５　６　７　８　９　１０　１１　１２　４００　ｂｐ　３００　ｂｐ　２００　ｂｐ　Ｂ—ａｃｔｉｎ　ＤＡＰＫ　１００　ｂＤ　图２不同浓度５－Ａｚａ—ＣｄＲ处理７２　ｈ后ＤＡＰＫ　ｍＲＮＡ表达情况　Ｍ：１００　ｂｐ　Ｍａｒｋｅｒ，１～３：对照组，４～６：Ｏ．５　ｂ￣ｍｏｌ／Ｌ组，７～９：５￣ｍｏｌ／Ｌ组，１Ｏ～１２：５０／，ｍｏｌ／Ｌ组　表１　ＤＡＰＫ　ｍＲＮＡ在肝癌细胞株ＳＭＭＣ７７２１中的表达情　况（３２±ｓ）　瘤细胞的异常生物学特征。在各种恶性肿瘤去甲基化实验　研究中均发现５－Ａｚａ－ＣｄＲ能够有效的抑制恶性肿瘤细胞的　增殖，如前列腺癌、膀胱癌、肺癌、鼻咽癌等　］。张雪妍等　。］　研究发现，肝癌细胞经不同浓度５－Ａｚａ—ＣｄＲ处理后，细胞生　长速度出现不同程度减慢，细胞克隆形成率显著降低。本研　究用不同浓度（０．５，５．０，５０．０“ｍｏｌ／Ｌ）去甲基化药物５－Ａｚａ—　ＣｄＲ处理肝癌细胞株ＳＭＭＣ７７２１细胞７２　ｈ后，发现５－Ａｚａ—　注：组间总体方差齐Ｐ一０．４０５，组间差异Ｆ一３６０．４１，　Ｐ＜Ｏ．Ｏ１，　表示任意两组比较均得出Ｐ＜Ｏ．０５　ＣｄＲ能明显抑制肝癌的增殖，与以上研究结果一致。　ＤＡＰＫ是以色列Ｋｉｍｃｈｉ等于１９９５年在基因组中扫描启　３　讨　论　５－Ａｚａ　ＣｄＲ是研究最广泛的去甲基化药物之一，它能够　动细胞凋亡的基因和抑癌基因时发现的一种钙调蛋白　（ＣＡＭ）调节的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，是凋亡的正性调节　因子之一，广泛参与多种途径介导的细胞凋亡，被认为是肿　瘤的抑制剂。ＤＡＰＫ启动子区ＣｐＧ岛高甲基化使基因转录　逆转基因的甲基化状态，从而恢复基因的表达水平，纠正肿　・　１６　・　广西医科大学学报２０１２　Ｆｅｂ；２９（１）　沉默而失去功能，与肿瘤细胞的形成以及转移有关而备受关　注［１　。在各种恶性肿瘤如乳腺癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、　宫颈癌等均发现ＤＡＰＫ基因ＣｐＧ岛有不同程度的高甲基　化。已有研究报道５－Ａｚａ—ＣｄＲ能够诱导人卵巢癌、膀胱癌、　鼻咽癌等细胞株细胞被抑制的ＤＡＰＫ　ｍＲＮＡ重新表达　，　但目前在国内外尚未发现５－Ａｚａ　ＣｄＲ对肝癌细胞株细胞　［５３于正洪，谢昆岭，史兆荣．甲基化干预在肿瘤治疗中的　研究进展［Ｊ］．现代肿瘤医学，２０１１，１９（１）：１９１－１９３．　［６］Ｆｅｉｎｓｔｅｉｎ　Ｅ，Ｄｒｕｃｋ　Ｔ，Ｋａｓｔｕｒｙ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ　ｏｆ　ＤＡＰ１　ａｎｄ　ＤＡＰＫ—　ｇｅｎｅｓ　ｔｈａｔ　ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ　ｍｅｄｉａｔｅ　ｐｒｏ—－　ｇｒａｍｍｅｄ　ｃｅｌｌ　ｄｅａｔｈ　ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ　ｂｙ　ＩＦＮ——ｇａｍｍａ—－—－ｔｏ　ｃｈｒｏ—－　ｍｏｓｏｍｅ　ｒｅｇｉｏｎｓ　５ｐ１２．２　ａｎｄ　９ｑ３４．１，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ［Ｊ］．　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９５，２９（１）：３０５—３０７．　ＤＡＰＫ基因表达影响相关报道。在本研究中，我们发现肝癌　ＳＭＭＣ７７２１细胞中凋亡基因ＤＡＰＫ　ｍＲＮＡ表达水平很弱。　［７］　钱　波，朱立新，耿小平，等．肝细胞癌ＭＧＭＴ、ＤＡＰＫ、　使用不同浓度的去甲基化药物５－Ａｚａ—ＣｄＲ处理ＳＭＭＣ７７２１　细胞后，５－Ａｚａ－ＣｄＲ可不同程度恢复ＤＡＰＫ　ｍＲＮＡ表达并且　ＴＨＢＳ１和ＲＩＺ１基因甲基化研究［Ｊ１．中华普通外科杂　志，２００５，２０（５）：２９１　２９４．　呈剂量依赖性逐渐升高，提示５　Ａｚａ—ＣｄＲ可能通过恢复　ＤＡＰＫ抑癌基因启动子的去甲基化水平从而诱导其重新表　达。５　Ａｚａ—ＣｄＲ是非特异性去甲基化药物，其具体作用机制　目前仍不清楚。李培坤等［１。一在研究中发现在５种肝癌细胞　系（ＳＵＮ４４９、ＢＥＬ　７４０２、ＳＭＭＣ一７７２１、Ｈｅｐ３Ｂ和Ｈｅｐ（ｉ２）中均　发现ＤＡＰＫ基因为非甲基化状态或者微甲基化状态。因此　ＤＡＰＫ的抑癌作用机制尚需进一步研究。　综上所述，本研究发现肝癌ＳＭＭＣ７７２１细胞中ＤＡＰＫ　表达沉默。５－Ａｚａ—ＣｄＲ可诱导ＳＭＭＣ７７２１细胞ＤＡＰＫ　ｍＲ　［８］　Ｇｈｏｓｈａｌ　Ｋ，Ｄａｔｔａ　Ｊ，Ｍａｊｕｍｄｅｒ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．５－Ａｚａ—ｄｅｏｘｙｃｙｔ　ｉｄｉｎｅ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｍｅｔｈｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　１　ｂｙ　ａ　ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ　ｐａｔｈｗａｙ　ｔｈａｔ　ｒｅｑｕｉｒｅｓ　ｔｈｅ　ＫＥＮ　ｂｏｘ，ｂｒｏｍｏ　ａｄｊａｃｅｎｔ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｄｏｍａｉｎ，ａｎｄ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｓｉｇｎａｌ　ＥＪ］．Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ，２００５，２５　（１１）：４７２７　４７４１．　［９］徐宁儒，刘春晓，郑少波，等．５杂氮脱氧胞苷逆转膀胱　癌Ｔ２４细胞死亡相关蛋白激酶的转录表达［Ｊ］．南方医　科大学学报，２００９，２９（９）：１　８８２—１　８８６．　ＮＡ表达，并抑制ＳＭＭＣ７７２１增殖。目前５－Ａｚａ—ＣｄＲ已经用　于白血病和多发性骨髓瘤的ｌ临床治疗Ｌ１　。因此本研究为肝　癌的治疗提供了新的思路，值得进一步深入研究。　［１Ｏ］张雪妍，张　煦．５一氮杂２　脱氧胞苷对ＨｅｐＧ２细胞　ＲＵＮＸ３基因表达及细胞增殖的影响［Ｊ］．基础医学与　临床，２００７，２７（３）：３１４　３１８．　参考文献：　［１］　黄金昶．原发性肝癌中医治疗体会［Ｊ］．中国临床医生，　２００６，３４（１０）：５９－６０．　［１１１姜晓东，胡世莲．死亡相关蛋白激酶与肿瘤关系的研究　进展［Ｊ］．中国临床保健杂志，２００８，１１（６）：６６８　６７１．　［１２］徐娟，许培箴，张玉泉．５氮２，－脱氧胞苷对人卵巢癌　细胞株ＯＶＣＡＲ一３凋亡及ＤＡＰＫ表达影响的研究［Ｊ］．　常州实用医学，２０１０，２６（３）：１４７—１５１．　［２］　Ｓｈｅｒｍａｎ　Ｍ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　［Ｊ］．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１０，７８（Ｓｕｐｐｌ　１）：７－１０．　［３］谢坤，朱立新．ＤＮＡ甲基化与肝癌的关系［Ｊ］．国际肿　［１３］李培坤，耿小平，朱立新，等．肝癌细胞系中ＳＬＩＴ２、　ＤＡＰＫ、ＲＩＺ１、ＣＨＦＲ、ＥＤＮＲＢ、３－ＯＳ基因甲基化状态　瘤学杂志，２００６，３３（３）：２２０—２２２．　［Ｊ］．安徽医科大学学报，２０１１，４６（５）：４１２　４１５．　［１４１　Ｉｓｓａ　Ｊｐ．ＤＮＡ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ａｓ　ａ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｔａｒｇｅｔ　ｉｎ　Ｅ４］张永彪，褚嘉祜．表观遗传学与人类疾病的研究进展　［Ｊ］．遗传，２００５，２７（３）：４６６—４７２．　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，２００７，１３（６）：１　６３４—１　６３７．　医学名词术语使用规范　名词、术语应统一，不要一义多词或一词多义。妇产科　找不到者，则以人民卫生出版社出版的《英汉医学词汇》、化　学、耳鼻咽喉科学、血液病学、呼吸病学、内分泌学和眼科学　的名词已由医学名词审定委员会审定公布，应严格执行，其　它尚未审定者，目前以下列两个主题词索引为准：①《主题词　学工业出版社出版的《药名词汇》和科学出版社出版的各学　科名词审定本为准。如“发烧”应改为“发热”，“红血球”应改　为“红细胞”，“血色素”应改为“血红蛋白”，“剖腹产术”应改　为“剖宫产术”等。国内尚无统一译名的，参考以上词典慎重　拟定，并在译名后加括号注外文，在医学名词审定委员会正　式公布后，应立即严格遵照执行。　索引》（见：医学主题词注释字顺表．北京：中国医学科学院医　学情报研究所，１９８４．７６１～９１４）；②《中医药主题词表》（中国　中医研究院图书情报研究所，１９８７）。在这两个主题词表中